Protoplast isolation and culture for banana regeneration via somatic embryogenesis

¹ Lab. Ecol. Syst. Evol., UMR 8079, Bât 362, Univ. Paris Sud XI, F- 91405 Orsay Cedex, France
² Univ. Guelph, Dep. Plant Agric., Bovey Building, N1G 2W1, Guelph, Ontario, Canada
³ Lab. Physiol. Vég., 227 Nguyen Van Cu, Q.5, Hô Chi Minh Ville, Viet Nam
⁴ Dép. Biol., Lab. Physiol. Vég., Fac. Sci. Rabat, Univ. Mohammed V Agdal, Ave. Ibn Battouta, BP 1014, 1000 Rabat, Maroc

Corresponding author: robert.haicour@u-psud.fr

Abstract

Introduction. This protocol describes a method for obtaining protoplasts from banana leaves, calli and cell suspensions, and their sustainable development via somatic embryogenesis from embryogenic cell suspensions. The principle, key advantages, starting plant material, time required and expected results are presented. Materials and methods. This part describes the required laboratory materials, and media preparation for protoplast production and culture. Results. The first protoplasts may be seen after 30 min of incubation in enzyme maceration. With protoplasts from embryogenic cell suspension, complete development into a whole plant, through somatic embryogenesis, is observed in 12 weeks. The first cell divisions occur on feeder layers 3–8 days after protoplast plating. Proembryo formation is observed 14–21 days after initiation of protoplast culture. The transfer of derived embryo plantlets, at 8–10 weeks after protoplast plating, onto growth regulator-free medium, leads to plant rooting and elongation.

Résumé

Introduction. Le protocole décrit une méthode qui permet d’obtenir des protoplastes à partir de feuilles, de cals et de suspensions cellulaires de bananiers, ainsi que le développement, par embryogenèse somatique, des protoplastes issus de suspensions cellulaires embryogènes. Le principe, les principaux avantages de la méthode, le matériel végétal de départ, le temps nécessaire et les résultats attendus sont présentés. Matériel et méthodes. Cette partie décrit le matériel de laboratoire nécessaire, la préparation des milieux pour l’obtention de protoplastes, ainsi que leur culture. Résultats. Dès la première demi-heure d’incubation dans la solution enzymatique, les premiers protoplastes sont libérés. En 12 semaines, les protoplastes, issus de suspensions cellulaires embryogènes, se développent en plantes entières via l’embryogenèse somatique. Sur les couches nourricières, les protoplastes reconstituent leur paroi ; les premières divisions cellulaires s’observent (3 à 8) jours après l’étalement des protoplastes. La formation des proembryons se déroule entre (14 et 21) jours après le début des cultures de protoplastes. Puis, (8 à 10) semaines après l’étalement des protoplastes, leur évolution embryogène conduit à des plantules qui s’enracinent et s’allongent après transfert sur un milieu dépourvu de facteurs de croissance.